RNA和DNA的分子结构示意图
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新冠病毒的遗传物质为RNA，由此归属为RNA病毒。RNA的单链结构更容易发生变异（也可以理解为进化），此次的新冠病毒其实也是经历了大量排列组合的“历练”以及“层层筛选”，最终“机缘巧合”地进化出兼具高度传染性和致病性的特点。
（二）核酸检测是什么
核酸检测顾名思义就是针对核酸开展检测。
核酸检测有何独特的优势呢？为何能作为新冠病毒确诊的“金标准”呢？
其实每一种检测方法都有其擅长的应用场景。以病毒检测为例，通常的免疫学检测方法（胶体金、ELISA、化学发光等）的检测对象是病毒的抗原或抗体，相当于“侧面描绘”。由于从感染到可检测存在一个时间窗口期，因此免疫学检测方法一般不合适作为早期诊断。
补充知识：
从机体对新冠病毒的体液免疫应答来看，新冠病毒的S蛋白、N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答，随后出现IgM抗体、IgA抗体、IgG抗体。遵从急性感染的一般过程，当IgG抗体出现后，IgM持续降低直至消失，IgG浓度会持续增加并较长时间存于血清中。但是IgM和IgG需要感染一段时间后才会产生。
而核酸检测的检测对象是病毒的遗传物质，则是“正面追击”。理论上只要有一个病毒就可以检测到，因此核酸检测很合适作为早期诊断。而且核酸检测可以针对病毒遗传物质中特定的特异性区域，因此特异性很高，一旦检测到，则可以判断为阳性。
及早地确诊疑似患者对抗击新冠病毒疫情至关重要。而核酸检测正是兼具合适早期诊断以及高度特异性的优点，从而成为了此次确诊感染的“金标准”。
核酸检测主要包括核酸电泳、核酸杂交、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、基因芯片、基因测序等。其中，PCR技术由于操作方便、可以快捷地获得定性或定量检测结果，是科研和临床中广为使用的一种核酸检测方法。
二
步入正题：PCR原理
PCR技术由Kary Mullis于1988年首创，技术上实现了在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列复制的过程。随着技术的发展，PCR已经衍生出很多不同的细分技术，例如quantitative PCR、multiplex-PCR，variable number of tandem repeats (VNTR) PCR，asymmetric PCR，nested PCR，touchdown PCR，digital PCR等等。
这么多技术，其实都绕不开最基本的PCR原理。
（一）PCR的基本过程
PCR一般会经历多轮温度循环，其中每一轮温度循环包括变性（denaturation）、退火（anealing）和延伸（elongation）三步。
变性是在高温（95℃左右）条件下，DNA模板双链打开的过程，使之能够与引物结合，为下面的反应做准备。退火是在冷却后（一般在68℃左右），变性后的DNA单链与引物通过碱基互补配对（A-T、C-G），再次形成局部双链。延伸是在DNA单链模板与引物特异性结合（俗称“接头”）之后，于72℃左右的温度下TaqDNA聚合酶发生作用，以脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP，主要包括dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP）为原料，以靶向序列为模板，碱基互补配对为原则，再次合成完整的双链DNA的过程。经过延伸复制之后，有一条链是新合成的，另一条则是原有模板，于是此种复制方式称为半保留复制（semiconservative replication）。
通过多轮温度循环，初始少量的DNA模板以“一变二、二变四”这样的指数扩增方式，最终得到大量复制的DNA模板产物。
PCR原理示意图
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PCR原理动态示意图
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（二）PCR反应的组成成分
PCR反应的组成成分主要包括检测模板（DNA template）、引物（primer）、Taq酶、dNTP、缓冲液（buffer）。
PCR的组成成分
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1、模板
模板一般为DNA，有时也称底物。在检测过程中，首先使用提取/纯化试剂盒将血液等样品中的全部核酸给提取出来，而待检的DNA模板则“混迹”于其中。
2、引物
引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’-端开始合成新的核酸链。
3、dNTP
dNTP主要包括dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP，dNTP是PCR扩增所需的基础原料。
4、酶
DNA聚合酶是PCR反应中的关键成分，其主要在延伸步骤中发挥作用。由于PCR中的延伸步骤一般在72℃左右进行，因此反应体系中的DNA聚合酶需在该高温下仍保持高效的活性。筛选合适的酶对提升反应效率、节约反应时间是最为直接有效的手段。最经常使用的便是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus 中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，简称Taq酶。
5、缓冲液
缓冲液为反应提供了均质稳定的反应环境，成分较为复杂。主要包括缓冲体系、Mg2+、辅助成分（维持酶的活性）等。
三
渐入佳境：逆转录PCR与荧光PCR
PCR相当于一个“放大器”，让我们有能力检测到微量或痕量DNA的踪迹。但实际检测中，并非所有的待检样本为双链DNA，例如新冠病毒的遗传物质便是单链RNA。
此时对于这类单链RNA将如何检测呢？在“看到”模板是否存在的基础上，是否可以“测量”模板多少呢？
这便衍生出逆转录PCR（reverse tranion-PCR, RT-PCR）和实时荧光定量PCR（realtime-PCR，常简称为荧光PCR、缩写为qPCR）技术。
（一）逆转录PCR
RNA是个单链，为了使用PCR手段对其进行检测，关键在于将RNA变成双链。
于是，RT-PCR则是先将单链RNA逆转录为双链cDNA（complementary DNA），然后再以cDNA为模板，历经PCR过程。
（二）荧光PCR
理论上，经典PCR中DNA模板的扩增遵循指数增长规律，但受限于实际反应条件，经过多轮循环后，PCR反应将进入“平台期”而产生偏离。对经典PCR终点的DNA模板进行检测，本质上仍是一种定性或半定量检测，可以用于判断待测核酸模板是否存在、以及相对含量多少 。
而realtime-PCR则实现了从定性检测向定量检测的飞跃。产生飞跃的关键因素，是在经典PCR中加入了荧光物质，通过实时检测荧光强度实现实时监测PCR过程（在一段区间范围内，荧光强度与模板数量呈正向线性关系）。根据荧光物质的特异性不同，可分为非特异性的荧光染料以及特异性的荧光探针两大类。
随着PCR的进行，可以绘制得出荧光信号强度随循环次数（测试时间）的一条曲线。
荧光信号强度-循环次数的曲线示例图
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对于所检测得到的弯曲曲线，如何对曲线进行定量分析呢？
关键在于定义一个荧光阈值（threshold）。所定义的threshold对应的循环阈值（ C t）与初始模板的数量多少息息相关，简单来说， C t与初始模板数量呈现负相关关系。
有兴趣的可以看以下推导过程：
定义n为循环次数，X0为初始模板数量，Xn为第n次循环后的模板数量，E为扩增效率。对于一个PCR过程，则满足
Xn= X0(1+E)n
其中，Xn与荧光信号强度满足正相关关系。
对于设定的threshold为一个常数K，则满足
XCt= X0(1+E)Ct= K
可推导出
lgX0= -Ctlg(1+E)+lgK
或
Ct= -lgX0/lg(1+E) + lgK/lg(1+E)
其中，对于一个特定的PCR过程，E和K均为常数，由此， X0与Ct为负相关关系。也即Ct越低，代表初始模板数量越高。
举一个小例子，让大家相对直观地感受一下初始模板数X0与Ct两者间的负相关关系。
某个试剂盒的扩增效率为100%，标准样品中含有100 个模板，对于设定的threshold，标准样品对应的 Ct,std为25.000 ；假设有两个未知样品（待测模板与标准样品的模板相同），样品A测试结果为 Ct,A为21.678 ，样品B测试结果 Ct,B为28.322 。那样品A和样品B分别对应多少个模板数呢？
计算结果如下：
K = XCt= 100×(1+1)25= 100×225
或
lgK ≈ 9.526
则对于样品A，
lgX0,A= -Ctlg(1+E) + lgK = -21.678×lg2 + 9.526
或
X0,A= 10-21.678×lg2 + 9.526≈ 1000
则对于样品B，可同理计算得到
X0,B= 10-28.322×lg2 + 9.526≈ 10
由此，可以相对直观地认识到初始模板数X0与Ct两者间的负相关关系。
（三）逆转录PCR联手荧光PCR
通过联合逆转录PCR和荧光PCR技术，则衍生出实时荧光逆转录聚合酶链式反应（realtime reverse tranion PCR, qRT-PCR）技术，由此可以对单链RNA进行定量检测。
为了检测新冠病毒的RNA，最合适的便是qRT-PCR了，由此也作为推荐检测方法写入了《新冠诊疗方案第七版》 。
四
实战演练：PCR用于病毒核酸检测
（一）判定标准
不同的qRT-PCR试剂盒的技术参数不同，具体的判定标准可能有微小差异，差异主要在于 C t的大小。
举个例子，假设某个或批的qRT-PCR试剂盒，循环数为40，选取参考 C t为37。
则当 C t为40或不存在时，判定为阴性。
当 C t<37时，判定为阳性。
若37< C t<40时，则建议对同样本再重做一次。若仍然 C t<40，扩增曲线有明显起降，该样本判定为阳性，否则为阴性。
（二）影响检测结果的若干因素
1、初始模板数量
若初始模板数量过低（低于试剂盒的最低检测限），则会出现检测不到的情况。
这有可能源于待测样本中的模板数本身比较少，也有可能源于提取试剂盒的提取、纯化效率太低，未能获得足够数量的模板。
在不考虑样品模板提取的情况下，通过调整PCR试剂盒里的组分构成、优化反应参数（温度、时间），可以一定程度地提升试剂盒的最低检测限 。
2、引物和探针
引物和探针的核酸序列设计是核心要点。
设计时一般会考虑引物和探针的核酸序列长度、对应靶序列的基因位点、退火温度、特异性结合效率、合成稳定性等因素。在研发过程中，设计引物和探针时时，一般会设计两套或多套引物和探针以供筛选，通过试验对包容性和特异性进行筛查评价，选择最佳组合。
对于新型冠状病毒，其拥有3万个碱基，不同区域与其他冠状病毒的相似性不同，为了实现特异性地识别新型冠状病毒，一般会选择相似度低的序列区域来设计引物和探针。
3、dNTP
dNTP主要包括dATP、dUTP、dGTP、dTTP、dCTP，其纯度、浓度会影响整体的检测过程。
4、酶
对于单链病毒定量检测而言，PCR反应体系中最重要的就是DNA聚合酶和逆转录酶。筛选合适的酶对提升反应效率、节约反应时间是最为直接有效的手段。
（二）假阳性与假阴性
1、假阳性
假阳性通常比较少。一般实验室人员操作不当会导致样本间交叉污染或扩增产物的遗留污染，该种情况下可能会导致假阳性。
不过假阳性可以通过严格控制检测流程、以及执行若干个阴性样本随机参与检测的策略而有效规避。
2、假阴性
在这里需要说明的是，PCR检测的假阴性与临床的假阴性实际上不是一个概念。
以网络上激烈讨论的新冠病毒的诊断为例，临床假阴性是指临床症状和影像学高度疑似被感染、但PCR检测却多次或始终为阴性的情况；而PCR检测假阴性是指所采集样本中存在足够量的新型冠状病毒但却没有检出的情况。
避免核酸检测的假阴性，主要需要解决：（1）被感染者的细胞中有足量的病毒、（2）采集样本中可以采集到含有病毒的细胞、以及（3）检测出样本中的病毒这三个环节。
其中PCR试剂盒的技术参数优劣主要影响第三个检测环节。
仅针对第三个检测环节，若样本中病毒数量低于一个程度（低于最低检测限），PCR试剂盒就无法检出。从这个角度看，PCR检测的假阴性是无法完全避免的。这也是为何需要补充开发病毒的特异抗体检测的原因所在。
五
回味收尾：PCR检测的那些事儿
说了这么多，简要总结下PCR检测。
PCR检测是核酸检测的一种重要技术手段。简单来说，通过PCR，那些看不见摸不着的DNA分子，在一个小小管子里，历经变性、退火、延伸，“轻而易举”的被扩增上百万倍，从而实现见微知著。
PCR已经是一个成熟技术了，由于具备灵活、便捷、快速等优势，在学术研究、临床应用中有非常广泛的应用。目前，针对PCR技术，仍然有大量的技术人员在进一步开拓衍生技术，主要的开拓方向简单概括就是追求更高、更快、更强。
追求更高，主要是进一步提高PCR的检测精度和灵敏性，主要包括单细胞模板检测、复杂样品中痕量模板的检测等 。
追求更快，主要是进一步缩短PCR 的检测时间，主要包括提高Taq 酶效率、合并退火延伸步骤、恒温等温扩增等技术。
追求更强，主要是进一步提高单次PCR 检测的通量以及提高PCR绝对定量分析的能力，主要包括研发多重PCR 、ddPCR等技术。
任何一种检测技术都有其优点和局限性。以qRT-PCR为代表的核酸检测具备方便快捷的优势，从而在抗击新冠病毒疫情中发挥了重要作用。但受待测样品来源、以及技术本身的限制，也不可避免地存在假阴性的情况。为了更好地确诊，qRT-PCR核酸检测搭配IgM/IgG抗体检测则是更为可靠的方法。
来源：康橙投资返回搜狐，查看更多